Ekstraksi Enzim Adenylate-kinase dari Otot Hewan

Our Score
Apakah artikel ini memuaskan?
[Total: 0 Average: 0]

Adenilat kinase merupakan enzim yang mengkatalis reaksi defosforilasi (pengurangan atom fosfor) ATP menjadi dua ADP dengan substrat ATP dan AMP membentuk produk dua buah ADP. Reaksi tersebut dibantu oleh magnesium. Enzim ini banyak terdapat pada hewan, terutama pada otot babi. Langkah-langkah ekstraksi enzim adenilat kinase dari sampel hewan adalah;

  • Potongan otot digerus dengan penambahan KCl 0.01 mol dm(-3) dan disaring dengan menggunakan kain saring
  • Aliquot diinkubasi pada pH 3,5 dan kemudian pH 7.0. Hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 derajat celcius selama 15 menit
  • Supernatant hasil sentrifugasi ditransfer kedalam wadah steril untuk pemurnian enzim
  • Enzim dimurnikan dengan memasukkan supernatan tersebut pada kolom kromatografi fosfoselulosa. Elute yang digunakan untuk pemurnian adalah AMP sebanyak 5mmol dm(-3)
  • Fraksi yang mamiliki aktivitas pembentukan ADP di-presipitasi menggunakan ammonium sulfat dan dilanjutkan dengan filtrasi gel menggunakan Sephadex G-75
  • Hasil fraksinasi yang memiliki aktivitas di kristalisasi dengan menggunakan metode saturasi ammonium sulfat 62 persen hasil enzim ditampung dan disimpan pada refrigenerator 4 derajat celsius untuk mencegah kerusakan enzim yang bersifat termolabil

Hal yang perlu diperhatikan dalam prosedur ini adalah:

  • Sel otot mudah rusak pada keadaan ionik yang rendah hingga memudahkan proses ekstraksi enzim
  • Keuntungan inkubasi aliquot ekstraksi pada tingkatan pH yang berbeda adalah untuk mengeliminasi protein non-enzim yang ada pada aliquot otot sampel
  • Kromatografi dengan menggunakan kolom fosfoselulosa merupakan metode kromatografi yang paling cocok untuk mengekstrak enzim adenilat kinase karena penggunaan AMP sebagai elusi memiliki afinitas tinggi terhadap enzim tersebut
  • Tujuan utama filtrasi gel pada langkah diatas adalah untuk memisahkan atau menghilangkan kontaminan protein yang berukuran Mr 60 000 dari ekstrak enzim yang diperoleh. Sedangkan metode dengan Sephadex G-75 memisahkan ekstrak enzim dari kontaminan yang berukuran 3000-70.000

Diterjemahkan dari: Fundamental of Enzymology, Oleh Price C. Nicholas dan Stevens, L. 1999. Diterbitkan oleh Oxford University Press.

Leave a Comment